上海：中科院神经科学研究所成功培育全球首个体细胞克隆猴

图为体细胞克隆猴。中科院神经所供图

　　题：呵护千猴成长 全球首个体细胞克隆猴诞生记

　　1月25日，国际顶尖学术期刊《细胞》以封面文章在线发表了中国科学家一项令世界瞩目的成果：成功培育全球首个体细胞克隆猴。

　　小猴“中中”，2017年11月27日诞生，是世界上首个体细胞克隆猴。同年12月5日，小猴“华华”诞生。这两只体细胞克隆猴均诞生于中国科学院神经科学研究所、脑科学与智能技术卓越创新中心的非人灵长类平台。

　　25日，团队在其成果“诞生地”——上海召开新闻发布会，尽管已是“第二场”，依然吸引境内外媒体闻讯而来，除了中国媒体，还有美国、英国、日本、澳大利亚媒体的身影。

　　此前“默默无闻”的这支体细胞克隆猴团队也揭秘了其“呵护千猴成长”的五载研究路。

　　“不能停的试验”

　　尽管自从1997年“多莉羊”体细胞克隆成功后，许多哺乳类动物的体细胞克隆也相继成功，但体细胞克隆猕猴迟迟未被攻克。

　　中国科学家团队的这个试验开始于2012年。团队成立之初，上海没有很好的设施和猴子基地，大家就在周边租了个场地，自己买菜做饭，白天黑夜轮班“泡”在基地。

　　去年春节，为了“中中”、“华华”出生，他们都没有回家。

　　“为何没停试验，主要是怕太耽误时间”，中国科学院神经科学研究所非人灵长类研究平台主任孙强说。

　　猴子月经周期为28天，只要一停就要停一个多月。于是孙强就跟团队成员们商量春节加班，他说：“咱们有可能会做一些重要的东西。”

　　猴子可不会告诉科学家哪天来月经，而且它们的出血量也不明显，需要兽医每天观察。

　　孙强介绍，为了保持猴子的健康状态，这上千只猴子被放在一个很大的空间里。每个动物房20多平方米，放10到15只猴子，“猴子是群居动物，不能单独养；这样每只猴子活动面积大概有2、3平方米，要看月经很困难，每天要追着猴子跑”。

　　猴子跑得很快，但中国科学家们“脑子动得更快”。他们利用了灵长类的聪明特性，慢慢和这些猴子建立了亲昵的关系，甚至让它们配合检查。

　　“国宝猴的妈妈”

　　“中中”、“华华”出生可不容易。

　　猴子的生产百分之八、九十都在后半夜。如果没有人照顾，母猴生产完，体力弱的话，不能把小猴抱起来，(小猴)就会冻死。又或者，母猴体力弱，就会难产。

　　怎么办？科学家们要观察猴子临产的症状：撅屁股、用力等等。

　　在基地的监控电视前，白天晚上都有人盯着，每半个小时给兽医总管发个信息。

　　有名兽医曾这样说：半夜一旦听到电话铃声，即使在被窝里睡得很香，也会跳起来，因为知道可能猴子有问题，需要来处理，像是得了职业病，听到电话铃声就像听到惊雷一样。

　　小猴出来后，还要精心护理。尤其这两只“国宝级”的克隆猴出生之后，十分珍贵。科学家们不敢将它们放回代母的怀里，怕万一代母不喜欢它们，或者某一天把它们杀掉。

　　兽医还要像妇产科护士、甚至妈妈一样照顾“中中”和“华华”。

　　目前这两只小猴被照顾得很好，在1月23日拍摄的视频中，两只小猴在保育箱里磨牙、玩耍……实力卖萌。

　　科学界的“奥林匹克冠军”

　　全球首个体细胞克隆猴的诞生，非常关键的是要有高超的技术。

　　中国科学院神经科学研究所非人灵长类研究平台博士后刘真能够在10秒以内从卵母细胞中取出细胞核，然后在很短的时间内将体细胞核注入去核卵母细胞。

　　现场一段52秒左右的视频中，他准确取出了6个细胞核。

　　中国科学院院士、中国科学院神经科学研究所所长蒲慕明说，10秒取核，目前在这个技术方面，刘真是“世界冠军”，“就好比很多人会做体操，但奥林匹克冠军就那么几个。”他介绍，接下来，团队准备开办训练班，训练一批人来做这件事。

　　他同时表示，目前这项技术已发表，中国科学家只比国外各大实验室快一年，要保持领先优势，一年时间内需要做出更重要的突破，“就是生产疾病模型猴，马上申请专利，产业化”。

 

　　中国克隆猴领先全球背后：同行成果是垫脚石，美国已偃旗息鼓

　　1997年2月，英国Roslin研究所伊恩 维尔穆特(Ian Wilmut)教授率领的团队在顶级学术期刊《自然》(Science)公布了“多莉”羊的诞生。这只实际上出生于1996年5月的首例体细胞克隆哺乳动物自此成为动物界的“明星”，也彻底颠覆了人类对生殖发育经典理论的认识。

 

 

　　资料图：两只体细胞克隆猴。中科院神经所供图。

 

　　“多莉”诞生22年之后，和人类最为接近的灵长类动物食蟹猴的克隆体诞生。这一次，突破性成果发生地是中国。中国科学院神经科学研究所孙强、蒲慕明领导的研究团队为最先诞生的这两只克隆猴取名为“中中”和“华华”。

　　该项成果历时5年，相关论文则于1月25日以封面文章的形式被《细胞》(Cell)杂志。罕见的是，论文从投稿到接收甚至历时不到一个月。这或许一定程度上反映了蒲慕明等人希望在世界范围内占据“克隆猴”优势的急切，“中国只比国外领先一年”，蒲慕明如此提及。

　　中国科学院院士季维智在接受澎湃新闻(www.thepaper.cn)采访时同样表示，“克隆猴的出现确实只是一个时间题。”

　　季维智是灵长类动物研究领域的权威，现任昆明理工大学灵长类转化医学院院长。上世纪90年代末，季维智在全球最顶级的非人灵长类研究机构——美国俄勒冈国家灵长类研究中心做访问学者。

　　当然，这并不是意味着“克隆猴”能够轻易完成，而是二十余年时间里久未出现进展的克隆技术在2014年终于有所突破，科学家对“克隆”的干预逐渐找到方向，一定程度上提高了克隆效率。

　　值得一提的是，在中国首创“克隆猴”之际，外界会联想到该领域曾经的领跑者美国——为何美国没能成功？答案是，2000年之后，美国科学界对克隆猴由“雄心勃勃”转为近乎 “偃旗息鼓”。分水岭之一是美国匹兹堡大学Gerald Schatten教授彼时的结论：基于“多莉”的克隆技术实现克隆猴是“行不通的”。Schatten此前经过6年尝试，其团队使用了724个猴卵，只培育出33个胚胎，最终无一成活。

　　美国“克隆猴”逐渐偃旗息鼓，并将研究的重心转向以CRISPR/Cas9为代表的基因编辑技术，但大洋彼岸的中国科学家却没有停下脚步。“一个是实验经费的问题，另一个是集中精力的问题，所以由中国创造了目前这个结果是很自然的。”季维智表示。

　　“克隆猴”技术难点

　　“多莉”诞生至今已有超过20种哺乳动物实现克隆，其技术均为体细胞核移植(Somatic Cell Nuclear Transfer，简称“SCNT”)。该技术原理并不复杂，研究人员将一种体细胞培养后注入去除遗传物质的卵子，通过人工方法激活后再移植到代孕母体发育成个体。

　　而克隆的核心在于，如何让已经高度分化的体细胞重新变回分化前的状态，这种类似“时光逆转”的反自然过程被称为“重编程”。季维智提到，“克隆难点就在于体细胞，科学家要解决的一个基本的科学问题就是，如何把高度分化的细胞变成多能性，具备像精子一样的功能。”

　　长期从事克隆研究的中国科学院广州生物医药与健康研究员、世界首例基因编辑克隆犬“龙龙”的培育者赖良学在接受澎湃新闻(www.thepaper.cn)采访时表示，“重编程是一个很复杂的过程，把细胞核放进一个卵子，这个卵子的环境是我们控制不了的。这就像我们把一个石头扔到一个大海里面，这个石头具体到了哪儿，将来流向哪里，我们是控制不了的，你也很难对它进行有效干预。”

　　根据孙强的介绍，克隆猴主要有三个难点。首先是细胞核不易识别，“去核”难度大。其次，克隆过程中，体细胞的细胞核进入卵细胞时，需先“唤醒”卵细胞，然后才启动一系列发育“程序”，但卵细胞容易提前激活。最后，体细胞克隆胚胎的发育效率低，绝大多数克隆胚胎都难以正常发育，往往胎死腹中。

　　在孙强团队的研究中，团队最终利用猴胎儿成纤维细胞进行核移植。最终将79枚克隆胚胎(处于二细胞期至囊胚期)移植入21只代孕母猴中，最终4只代孕成功的母猴有两只流产，剩下两只正常怀孕超过140天，然后通过剖腹产手段获得两只存活的猴，即“中中”和“华华”

　　“中中”和“华华”诞生的垫脚石

　　体细胞重编程的难以控制，使得动物克隆效率极为低下，长期停留在1%以下的水平。

　　对于此次克隆猴的成功，未曾走出国门留学、自称“土鳖一代”的孙强率领的团队毫无疑问是功臣，其中诸多媒体争相报道的即是论文第一作者刘真博士耗时3年训练的快速“去核”、“注核”的本事。

　　蒲慕明提到刘真时表示，“体细胞核移植技术流程非常关键，操作越快，卵细胞受损就会越小，刘博士在这方面做的很出色。刘真可能在10秒之内对卵母细胞进行细胞去核操作，在15秒之内将体细胞注入到卵母细胞当中。”在蒲慕明和孙强的眼里，就细胞“去核”、“注核”技术，刘真是当之无愧的“世界冠军”。

　　对于孙强团队的成功，季维智表示，“显微操作的时候技术熟练是条件之一，另一个成功的关键在于他们找到了体细胞去甲基化、乙酰化的合适配方。”谈及体细胞的去甲基化、乙酰化，绕不开孙强团队成功的垫脚石。

　　体细胞甲基化、乙酰化实际上都是体细胞重编程过程中的表观遗传修饰障碍。无论DNA、RNA还是蛋白质，其表面均有例如甲基、乙酰基等的额外基团，这些基团就被称为“修饰”，它们受细胞状态影响，也能反过来影响细胞状态。

　　克服表观遗传修饰障碍的转机出现在2014年。华裔科学家、美国哈佛医学院教授张毅实验室的研究发现，在体细胞核移植实验中，组蛋白H3K9me3的修饰所介导的转录沉默是阻挡细胞重编程进行的“屏障”，加入去甲基化酶Kdm4d就可以使得重编程效率大大增加。

　　随后的2016年，上海同济大学的高绍荣团队也发现，联合使用去甲基化酶Kdm4b和Kdm5b能极大提高小鼠克隆胚胎的囊胚率及出生率。而早在2006年，日本理化学研究所RIKEN的Wakayama团队则发现TSA能提高小鼠克隆效率，TSA就是一种乙酰化酶抑制剂。

　　赖良学表示，“在张毅的这项研究之前，各个实验室也都在想办法进行干预，但大都没找到关键点。”而季维智上述提到的“合适配方”指的则是，孙强团队此番在体细胞核移植体系中找到了TSA和Kdm4d的理想浓度组合。

　　由此看来，“中中”和“华华”的诞生实际上并不是单个实验室的成果，更像是克隆领域近几年发展的一项集成。高绍荣在点评该成果时也表示，“离不开科学家们长期以来对克隆胚胎重编程机制的研究”。也正是基于科学家近年来的突破性进展，季维智才认为，“克隆猴确实只是一个时间问题了。”

　　2000年后美国基本“偃旗息鼓”

　　中国此番获得全球首例克隆猴，被称为“弯道超车”。

　　曾经克隆猴领域的领跑者当属美国。曾被科学界认为最可能第一个克隆出猴子的即是美国俄勒冈灵长类研究中心的著名科学家美籍哈萨克斯坦科学家沙乌科莱特 米塔利波夫(Shoukhrat Mitalipov)。

　　早在2007年，米塔利波夫团队在《自然》发表成果：利用细胞核转移技术，成功用猴子皮肤细胞克隆出胚胎，并提取出两个干细胞系。这是人类首次以体细胞克隆的方式获得灵长类胚胎。

　　2010年，米塔利波夫率领团队更是成功移植了克隆猴胚胎，但胚胎发育至81天，以流产告终。这也是在孙强团队完成克隆之前，全球离实现克隆猴距离最近的一项研究。

　　而在米塔利波夫之前，美国的科学家在2000年时曾宣布用胚胎分裂的方式对猴进行克隆。研究人员把107个猴胚胎分裂成368个胚胎，结果有4个发育成熟但胎死腹中，只有一只在胚胎分裂157天之后幸运地降生。这只也就是曾经一度被称为首次成功克隆获得的灵长类动物“Tetra”。

　　但实际上，胚胎分裂方式并不是真正意义上的的体细胞克隆，因此也未引起过多关注。

　　然而，除了米塔利波夫团队，美国在克隆研究的巅峰期之后又如何看待这项研究？季维智和赖良学都提及，“近十几年来，美国已鲜有实验室研究克隆候。”

　　赖良学提及，Schatten在2000年左右提出的基于“多莉”的克隆技术实现克隆猴是“行不通的”，这无疑是给美国克隆研究“泼了冷水”。

　　“Schatten当时用体细胞克隆，他认为胚胎发育超越不了八细胞期(哺乳动物早期胚胎发育的一个阶段)。”季维智也同样表示，“实际上，我们在2007年就把这个观点否定掉了，我们当时就发现是可以达到囊胚阶段的。并且还证明了，跟正常的胚胎相比，克隆胚胎在八细胞期和二细胞期的时候确实是有很高的DNA甲基化水平。”该项研究由季维智和中科院动物所周琪团队合作完成，也是首次证明了克隆胚胎的甲基化水平异常。

　　针对克隆猴近十几年来在美国遇冷的现象，赖良学认为，“猴子毕竟是灵长类动物，成本很高，不像其它实验一样，各种方法、技术都去试。如果一段时间试不出来，经费又用完了，很多实验室可能也就停掉了克隆实验。”

　　不过，在季维智看来，经费、甚至猴子资源都不是美国近十几年来在克隆猴方面遇冷的根本原因。“这些有一定影响，但关键是美国的兴奋点没有放在克隆上面了，而是转向了基因编辑等其他领域。”

　　此番克隆猴的出现，会在全球范围内再次刮起一场克隆巅峰吗？答案拭目以待。不过，蒲慕明在成果发布之际曾提到，“基因编辑在胚胎克隆上有很多问题无法解决，比如脱靶等。但在体细胞克隆上进行基因编辑时，这些问题都比较容易解决。”